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「中国创造70年」“克隆猴”诞生背后:孤岛建猴场,试错5年

导读:2017年11月27日,世界上首个体细胞克隆猴“中中”在中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心的非人灵长类平台诞生;12月5日第二个克隆猴“华华”诞生。该成果标志中国率先开启了以体细胞克隆猴作为实验动

口述:孙强,中国科学院脑科学与智能技术卓越中心非人灵长类研究平台主任

安排:中国经济周刊记者宋杰

2017年11月27日,世界上第一只单细胞克隆猴“中中”诞生在中国科学院脑科学与智能技术卓越中心(神经科学研究所)的非人灵长类平台上。第二只克隆猴子华华于12月5日出生。这一成就标志着中国率先开启了以体细胞克隆猴为实验动物模型的新时代,实现了中国在非人灵长类研究领域从国际“平行运行”向“领先运行”的转变。

体细胞克隆猴“中中”和“花花”的日常生活

精子和卵子各携带一半的遗传物质,并相互结合形成受精卵,发育成新的个体。这是一种众所周知的哺乳动物繁殖方法。然而,体细胞克隆使用“灵猫为王子”(civet cats for prince)的方法,用染色体(即脱氧核糖核酸)代替卵细胞中的脱氧核糖核酸,然后让卵细胞用体细胞中的脱氧核糖核酸完成新个体的孕育。困难是不言而喻的。

自1997年成功克隆多莉羊体细胞以来,世界上许多生物医学机构已经克隆了20多种哺乳动物。其中,实验小鼠是生命科学研究和新药研发中最重要的模型动物之一。他们在发现生命奥秘和帮助人类开发新药方面为科学家做出了杰出的贡献。

然而,只有一个目标能让世界顶级科研团队紧紧关注猴子。由于灵长类进化与人类非常接近,因此在了解人脑、脑认知功能和脑部疾病方面具有巨大的潜在应用价值。

21世纪初,美国匹兹堡大学的研究人员在《科学》杂志上写道,用体细胞克隆非人灵长类动物的理想是不可能的。当时,俄勒冈大学的米塔利波夫教授写道,科学家应该在无法到达的科学道路上发现不寻常的风景。但是在2011年,他尝试了15000个猴卵后失败了:他创造的克隆猴在怀孕81天后流产了。这已经是这一领域的最佳成就。

中国科学家能取得突破吗?可以。中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)研究员孙强带领博士后刘真领导的团队。经过五年的不懈努力,非人灵长类动物体细胞克隆终于在世界上首次实现。

2017年11月27日,世界上第一只单细胞克隆猴“中中”诞生在中国科学院脑科学与智能技术卓越中心(神经科学研究所)的非人灵长类平台上。第二只克隆猴子华华于12月5日出生。这一成就标志着中国率先开启了以体细胞克隆猴为实验动物模型的新时代,实现了中国在非人灵长类研究领域从国际“平行运行”向“领先运行”的转变。

那么,这个里程碑式变化背后的故事是什么?本文是中国科学院脑科学与智能技术卓越中心非人灵长类研究平台主任孙强对中国活体克隆猴从孕育到诞生的全过程的回顾,并授权《中国经济周刊》出版。

从零开始遇见伯乐

团队的主要成员:蒲慕明(中心)、孙强(左)和刘真(右)(由中国科学院大脑和智能卓越中心提供)

2001年,国外出现了转基因猴子。那时,中国还没有转基因猴子,甚至试管猴子也没有报道。然而,早在1984年外国就有试管猴子。

为了制造转基因猴子,我没有选择在博士毕业后出国做博士后。相反,我在2004年去了西双版纳的一个山区农场,进行猴子生殖生理和转基因猴子的构建研究。这个决定对我来说不容易。那时,我的妻子和孩子都在扬州,我每两个月才回家一次。虽然我每次上山下山都要坐缆车去买菜,但我已经在这里呆了将近4年了。

经过近4年的努力,虽然非人灵长类辅助生殖技术和试管猴已经掌握,但转基因猴还没有获得。随着原单位研究项目的结束,我继续研究非人灵长类动物的研究条件也将丧失。虽然我的心仍在思考我热爱并致力于的研究领域,但真正的困境迫使我考虑改变研究方向。

幸运的是,2009年,与中国科学院神经科学研究所制定的分阶段发展“路线图”目标相吻合,该研究所计划开辟一个具有应用价值的非人灵长类研究领域,引领学科发展,增强国际科技竞争力。神经科学研究所的蒲慕明院士感受到我从事非人灵长类动物研究的强烈科研愿望,决定委托我承担建立非人灵长类动物研究平台的重要任务。我热爱的科研事业迎来了梦想的春天。

上古岛建猴场

到达神经中心后,考虑到从头开始建设非人灵长类动物设施需要几年时间,我再次选择租赁设施,尽快在远离家乡和核心城市的太湖一个岛上的猴子农场开工。

岛上最初的交通工具是自行车和电池车,这使得我们可以方便地从镇上收集试剂和消耗品等快递包裹。如果我们想离开这个岛,我们主要乘远离城市的69路公共汽车。我们需要乘60路公共汽车去火车站。

在早期,岛上没有餐厅,吃饭也是一个需要解决的问题。我们为每个宿舍提供厨房。每个人轮流买食物和做饭。假期到来时,我们还组织了一些集体晚餐,让每个人展示他们的烹饪技巧。这不仅解决了生活中的问题,也增强了同事之间的感情。在生活中,我们就像一家人。在工作中,实验室是我们的家。由于潮湿,实验室一楼的墙壁变黄,甚至发霉,所以工作人员组织起来,利用空闲时间粉刷墙壁和天花板,美化他们的家。

在2010年国庆假期的一个雨夜,我在从基地返回宿舍的路上没有路灯就弄断了锁骨。但这是当时实验的关键点,没有人接受过替代我的训练,所以我不得不将手臂再垂一周。当实验在治疗前完成时,医生发现折断的锁骨脱臼了,不得不切断并重新连接。

这些努力是值得的。2011年,我们成功获得了世界上第一个携带人类自闭症基因的猴子模型。此后,我们成功开发了实验猴的加速成熟技术,将食蟹猴的繁殖周期从5年以上缩短到2.5年。我们还建立了基于分子核酸酶的基因编辑猴模型构建技术,促进了中国非人灵长类动物的研究。

然而,用上述方法构建的模型猴仍然存在嵌合现象、靶位缺失和第一只动物遗传背景不均匀的问题。2012年,我坚定地接过征服非人灵长类体细胞克隆技术的重任,试图解决这些问题。

试错5年“循序渐进”

在过去的20年里,世界上许多顶级实验室都失败了。世界公认的克隆专家米塔利波夫前后使用了15000枚猴卵,但仍然失败。一度,国际上悲观的观点认为用体细胞克隆猴子是不可能的。尽管如此,我和我的团队还是冒着长期失败的风险开始了体细胞克隆技术的研究。

但是我必须考虑如何在以前失败的基础上解决关键问题。用体细胞克隆猴子的实验已经进行了5年,我的团队也失败了5年。深深的沮丧常常让每个人都感到非常痛苦和沮丧。我也经常鼓励每个人做最坏的打算,尽力而为。

体细胞猴克隆技术的具体操作有两大难点。第一,当细胞核被移除时,细胞核周围太多的营养物质不能被移除,否则细胞将停止发育。此外,只表达特定基因的成熟体细胞的细胞核被移植到卵细胞中,研究人员需要找到使其再次成为未分化的全方位胚胎细胞的方法。

因为猴细胞是不透明的,显微镜下看不到细胞核,需要偏振光来显示细胞核。我们的研究人员看着显微镜,在闪烁的偏振光下,要操作直径约为10微米的非常细的针头吸入和注射细胞,并尽可能减少对细胞的损伤,要比操作绣花针困难得多。最终,我们的团队成员可以在15秒内完成体细胞注射,只有精湛的技术才能保证对卵细胞的损伤最小。

然而,在核基因组开始之前,体细胞核经历了一个回到早期胚胎核状态的过程,即“重编程”。只有通过控制这一过程,才能提高体细胞胚的发育率。

合作经营

讲一个小故事。因为平台上的猴子被保持在室温下,所以当天气冷或热时,每个人都特别担心。我记得2016年的抗洪救灾是一个周末,神经中心每小时联系我们,包括晚上。周日下午2点,水位已经非常危险了。那时,只有人可以进入。研究所的领导很担心我们,他对我说,“仪器和猴子不需要照顾。你必须迅速撤退。”

但是当我们再次打电话时,我告诉他仪器已经搬回来了。当时,他非常惊讶,问我去哪里取款,这样我就可以这么快回来。我说,“是女人撤退了,而男人都在等着。”只有本着这种热爱集体、国家利益大于自身利益的精神,才能取得重大突破。

2014年,我们在一份报告中看到了一种新的酶处理方法,在尝试了各种控制方法后,结果并不令人满意。最终胚泡率提高到45%,优质胚胎率提高到29%。最后,我们使用了127个卵母细胞,制作了109个重构胚胎,移植了21个猴受体,获得了6个妊娠受体,最终只有2个在2017年成功出生。

突破世界前沿问题需要一个能干而高效的研究团队。“志同道合”是让我们一起战斗的关键。作为一名“队长”,我必须与团队同甘共苦,而不是发号施令的“老板”。我和所有人住在基地里,一起吃饭和生活。对于初学者来说,我会从头开始教他们,这样他们就可以快速成长,同时培养他们的使命感、荣誉感和归属感。

在我的团队里,学位和背景都是虚荣的东西。他们中的大多数没有明亮耀眼的背景。然而,经过我们平台的培训和大胆探索,他们已经成为具有“特殊技能”的顶尖人才,在各自的岗位上发挥着核心作用。正是每个人的“协同努力”最终导致了我们的成功。

2017年底,在经历了五年的艰辛之后,它终于得到了回报。世界上第一只克隆猴子“中中”和“花花”成功诞生。这项工作也被评价为“新的里程碑”突破。

关于命名

每个人都对“中国”和“华华”的名字很感兴趣。外国媒体也解释“中国”的名称。

当时,蒲慕明院士与我们的团队讨论过,如果这份学术论文要提交,那两个克隆猴宝宝应该有名字。它们应该叫什么?蒲院士看着我和刘真说:你们有“特权”,每人一个,叫做“蔷蔷”和“甄珍”,意思是“镇强”?我们两个几乎同时摇头,说应该任命蒲院士。

他想了一会儿,问“中国”怎么样。“中国”和“华华”。我们一致同意了!虽然只需要几分钟就能说出它的名字,但当我后来想起它时,中国文艺复兴的梦想已经藏在每个人的心里很久了。

克隆猴体细胞的成功是由于有利的天气、地理位置、人类的和谐,这是不可或缺的。

掌握体细胞猴克隆技术仅仅是个开始。接下来,我们将组织更多的努力,尽快开发出世界上第一批利用体细胞猴克隆技术开发的疾病模型猴和工具猴。

展望未来,我们将继续在体细胞猴克隆领域取得重大突破,抓住世界疾病猴克隆模型发展的第一个机遇,努力获得世界上第一批克隆的阿尔茨海默病、帕金森综合征等脑部疾病猴模型,为脑部疾病的机制研究、干预、诊断和治疗贡献自己的力量。

此外,积极探索相关技术产业化,推动中国率先发展基于非人灵长类疾病动物模型的全新药物研发产业链,推动以脑部疾病、免疫缺陷、肿瘤和代谢性疾病为重点的新药研发进程,为人类健康和中国经济发展做出贡献。

附言:

2019年1月,孙强团队与同样隶属于中国科学院大脑智能中心的张红军团队合作,取得了另一项成功:在利用crispr/cas9技术成功构建世界首个核心节律基因bmal1敲除猕猴模型的基础上,孙强团队从症状最明显的雄性猴子的体细胞中克隆了5只小猴子。这一进展表明,中国科学家已经能够大规模生产具有统一遗传背景的疾病猕猴模型。

编辑|陈冬冬

编辑|张伟

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